UJI AKTIFITAS BIOKIMIA

PERCOBAAN II

       I.            Judul praktikum                      : Uji Aktifitas Biokimia

    II.            Hari / Tanggal                         :

 III.            Prinsip kerja                            : TSIA ® Penurunan gula dan diiringi produksi 

asam  dideteksi dengan indokator pH phenol red. Yang merubah warna media dari merah muda-orange menjadi kuning dan pada alkalinitas berubah menjadi merah pekat. Thiosulfat oleh beberapa spesies hydrogen sulfide beraksi dengan iron sald membentuk sulfida hitam

                                                               SCA ® Bakteri menggunakan sitrat sumber

Sebagai sumber carbon tunggal, dengan bantuan enzim sitrat permaese maka akan bakteri akan menyebarkan citrate ke dalam sel. Selain itu bakteri mengubah ammonium dihidrogen phosfat menjadi hidroksida (NH₃) dan amoniak yang bersifat basa. Pada pH 7,5 kertas indicator BTB akan berwarna biru sedangkan pada pH netral akan berwarna hijau.

                                                               MR ® Uji  metil  red  +  indicator metil red 

pada  media pepton yang ditanami bakteri -> test positif (merah)

                                                               VP ® Reagen    Vp   +   pada   media     yang 

Ditanami bacteria, hasil akhir fermentasi -> aseton yang mengandung KOH akan teroksidasi menjadi diacetil warna merah karena adanya keratin sebagai katalisator

                                                               SIM Sulfur ® Menjadi     hydrogen    sulfida    

dengan zat besi menjadi ferric sulfida yang mengendap menjadi hitam

                                                                        Indol ® Bakteri   menghasilkan   enzim 

trytophase yang dapat menghidrolisis tryptopan. Hasilnya indol.

                                                                        Motility ® Pergerakan bakteri -> awan

purih tipis.

 IV.            Tujuan praktikum                    : ® Untuk melihat aktifitas mikroorganime dari

perubahan warna, gas, dan H₂S pada media TSIA

®    Untuk melihat aktifitas mikroorganisme dengan melihat adanya perubahan warna karena adanya enzim citrate

®    Untuk melihat aktifitas mikroorganisme dari H₂S, gugus indol, dan pergerakan bakteri pada media SIM

®    Untuk melihat aktifitas mikroorganisme dengan melihat adanya asam campuran pada media MR

®    Untuk melihat aktivitas mikroorganisme dengan melihat 2,3 butanadiol pada media VP

    V.            Maksud praktium                    : Untuk mengetahui dan  memahami terjadinya

aktifita biokimia pada media TSIA, SCA, SIM, MR dan VP.        

 VI.            Landasan teori

Biokimia merupakan ilmu yang mempelajari tentang senyawa-senyawa yang ada di dalam sistem hidup, penyusunan senyawa-senyawa tersebut ke dalam sel-sel dan interaksi kimia yang terjadi. Sel-sel pada makhluk hidup tersusun dari biomolekul. Untuk dapat mempertahankan hidup, sel-sel mengalami metabolisme (reaksi pada sel). Dalam metabolisme, sel menyerap energi dari makanan atau nutrisinya, energi ini digunakan untuk membentuk biomolekul penyusun sel(Lehninger, 1995).

Karakterisasi dan klasifikasi sebagian besar mikroba seperti bakteri berdasarkan pada reaksi enzimatik ataupun biokimia. Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe media, memproduksi tipe metabolit tertentu yang di deteksidengan interaksi mikroba dengan reagen tes yang menghasilkan warna reagen. Reaksi-reaksi dalam sel akan teridentifikasi dengan melakukan pengujian-pengujian tertentu. Sel akan memberikan respon sesuai dengan kemampuan yang dimilikinya, misalnya menghasilkan enzim katalase, enzim gelatinase atau kemamupuan untuuk menghidrolisis lemak(Lehninger, 1995).

Secara morfologis, biakan maupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa. Karena itu ciri fisiologis atau biokimiawi merupakan kriteria yang amat penting di dalam identifikasi spesimen yang tidak dikenal. Tanpa hasil pengamatan fisiologis yang memadai mengenai organisme yang diperiksa maka penentuan spesiesnya tidaklah mungkin dilakukan(Lehninger, 1995).

Uji biokimia adalah pengujian larutan atau zat-zat kimia dari bahan-bahan dan proses-proses yang terjadi dalam tubuh makhluk hidup, sebagai upaya untuk memahami proses kehidupan dari sisi kimia (Lehninger, 1995).

Biokimia bertujuan untuk memahami bagaimana interaksi biomolekul satu dengan lainnya yang membawa sifat-sifat kehidupan ini. Belum pernah dalam pengamatan logika molekul sel hidup, kita menemukan suatu pelanggaran terhadap hukum-hukum yang telah dikenal, seiring dengan itu pula, kita belum pernah memerlukan pendefinisian hukum baru. Mesin organik lunak sel hidup berfungsi di dalam kerangka hukum-hukum yang sama mengatur mesin  buatan manusia. Akan tetapi, reaksi-reaksi kimia dan proses pengaturan sel telah maju demikian pesat, melampaui kemampuan kerja mesin buatan manusia (Lehninger, 1995).

 Ciri biokimia merupakan kriteria yang amat penting di dalam identifikasi spesimen bakteri yang tak dikenal karena secara morfologis biakan ataupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa, tanpa hasil pengamatan fisiologis yang memadai mengenai organik yang diperiksa maka penentuan spesiesnya tidak mungkin dilakukan. Karakteristik dan klasifikasi sebagai mikroba seperti bakteri berdasarkan pada reaksi enzimatik ataupun biokimia. Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe media memproduksi metabolit tentunya yang dideteksi dengan interaksi mikroba dengan reagen test yang mana menghasilkan perubahan warna reagen (Murray, 2005).

Uji fisiologi bisanya identik dengan uji biokimia. Uji biokimia yang biasanya dipakai dalam kegiatan identifikasi bakteri atau mikroorganisme yang antara lain uji katalase, koagulase, dan lain-lain. Pengujian biokimia merupakan salah satu hal yang sangat penting dalam dunia mikrobiologi (Lim, 1998).

Uji-uji biokimia yang biasanya dipakai dalam kegiatan identifikasi bakteri atau mikroorganisme yaitu antara lain adalah uji MR-VP, uji gula-gula, uji SIM, Uji TSIA, Uji Indol, dan Uji Simmons Citrate (Dwidjoseputro, 1954).

Catalase test	ONPG test	Mhetyl Res Test	Malonate broth	Urease test	Glatinase test	Oxidase test
(+)	(+)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)

Gula gula
Mannitol	Glucose OF Medium
Acid kuning	Fermentative

VII.            Metode kerja

A.    Pra Analitik

1.      Persiapan Media          : Tidak ada persiapan khusus

2.      Persiapan bakteri         : Tidak ada persiapan khusus

3.      Alat dan Bahan

a.       Alat yang digunakan

1)      Lampu Spiritus

2)      Rak tabung

3)      Tabung reaksi berisi media dan bakteri

4)      Ose bulat

5)      Ose lurus

b.      Bahan yang digunakan

1)      Alkohol

2)      Bakteri Vibrio

3)      Korek api

4)      Kapas

5)      Media TSIA, SCA, MR, VP, dan SIM.

B.     Analitik

1.      Prosedur kerja media TSIA

1)      Disiapakan alat dan bahan

2)      Dipanaskan ose dari ujung ke pangkal sampai terpijar

3)      Diinokulasikan bakteri Vibrio kedalam media TSIA dengan cara tusukkan lurus kemudian gores secara sinambung diatas permukaan medium tersebut

4)      Dipanaskan kembali ose dari pangkal ke ujung sampai terpijar

5)      Diinkubasi pada suhu  37^oC selama 24 jam.

6)      Diamati perubahan yang terjadi

2.      Prosedur kerja media SCA

1)      Disiapakan alat dan bahan

2)      Dipanaskan ose dari ujung ke pangkal sampai terpijar

3)      Diinokulasikan bakteri Vibrio pada media SCA

4)      Dipanaskan kembali ose dari pangkal ke ujung sampai terpijar

5)      Diinkubasi pada suhu  37^oC selama 24 jam.

6)      Diamati perubahan yang terjadi

3.      Prosedur kerja media SIM

1)      Disiapakan alat dan bahan

2)      Dipanaskan ose dari ujung ke pangkal sampai terpijar

3)      Diinokulasikan bakteri Vibrio ke media SIM dengan cara tusuk

4)      Dipanaskan kembali ose dari pangkal ke ujung sampai terpijar

5)      Diinkubasi pada suhu  37^oC selama 24 jam.

6)      Amati sulfur dan motility yang terjadi

7)      Amati terjadinya indol dengan menambahkan 1mL larutan reagen Ehrlich atau Kovac ke dalam setiap tabung

8)      Kocoklah perlahan-lahan dan biakan tabung berada dalam posisi tegak agar larutan reagen dapat terkumpul dipermukaan medium.

9)      Dilihat adanya indol dengan timbulnya warna merah tua pada lapisan atas permukaan media.

10)  Dibandingkan hasil dengan tabung control

4.      Prosedur kerja media MR

1)      Disiapakan alat dan bahan

2)      Dipanaskan ose dari ujung ke pangkal sampai terpijar

3)      Diinokulasikan bakteri kedala tabung medium MR

4)      Dipanaskan kembali ose dari pangkal ke ujung sampai terpijar

5)      Diinkubasi pada suhu  37^oC selama 24 jam.

6)      Diamati perubahan warna yang terjadi

5.      Prosedur kerja media VP

1)      Disiapakan alat dan bahan

2)      Dipanaskan ose dari ujung ke pangkal sampai terpijar

3)      Diinokulasikan bakteri pada media VP dengan cara tusuk

4)      Dipanaskan kembali ose dari pangkal ke ujung sampai terpijar

5)      Diinkubasi pada suhu  37^oC selama 24 jam.

6)      Diamati perubahan warna yang terjadi

C.     Pasca Analitik

1.      Hasil pengamatan

a.       Media TSIA

No.	Nama Media	Hasil Pengamatan
		L	D	H2S	Gas
1.	TSIA	AL	AC	-	-
2.		AL	AC	-	-
3.		AL	AC	-	-
4.		AL	AC	-	-
5.		AL	AC	-	-

                                               

b.      Media SCA

No.	Nama Media	Hasil Pengamatan	Keterangan
1.	SCA	+	Biru
2.		+	Biru
3.		+	Biru
4.		+	Biru
5.		+	Biru

       

c.       Media SIM

No.	Nama Media	Hasil Pengamatan
		H2S	Indol	Motility
1.	SIM	+	-	-
2.		+	-	-
3.		+	-	-
4.		+	-	-
5.		+	-	-

                                               

d.      Media MR

No.	Nama media	Hasil Pengamatan
1.	MR	+
2.		+
3.		+
5.		+
6.		+

                                               

e.       Media VP

No.	Nama Media	Hasil Pengmatan
1.	Vp	-
2.		-
3.		-
4.		-
5.		-

                                                              

VIII.            Pembahasan

Fermentasi merupakan salah satu aktivitas biokimia yang dilakukan oleh mikroba. Fermentasi adalah proses pengunahan senyawa makromolekul organik menjadi senyawa yang lebih sederhana oleh aktivitas mikroba pada kondisi anaerob. Fermentasi dapat menghasilkan berbagai senyawa akhir, contohnya fermentasi karbohidrat yang dapat menghasilkan berbagai senyawa asam seperti asam laktat dan propionet, ester-ester, keton dan gas.

Sebagian besar mikroorganisme memperoleh energi dari substrat berupa karbohidrat yang selanjutnya di fermentasi menghasilkan asam-asam organik (seperti asam laktat, format, asetat), dengan disertai atau tidak disertai pembentukan gas. Organisme-organisme yang berbeda akan menggunakan karbohidrat/gula-gula yang berbeda tergantung dari komponen enzim yang dimilikinya. Perbenihan gula-gula digunakan untuk melihat adanya pembentukan asam yaitu dengan adanya perubahan warna indikator (merah fenol atau biru bromtimol) yang terdapat dalam perbenihan menjadi kuning yang sebelum ditanami berwarna merah (indikator merah fenol) atau berwarna biru (indikator biru bromtimol) serta untuk pembentukan gas, yaitu dengan terlihatnyaudara di dalam tabung peragian/fermentasi (tabung durham). Jenis karbohidrat yang digunakan pada uji fermentasi karbohidrat antara lain: Sukrosa, Laktosa, Maltosa, Manitol. Glukosa dapat langsung masuk dalam jalur fermentasi tahap pertama. Sedangkan, sukrosa, laktosa mantol, dan maltosa akan di hidrolisis terlebih dahulu menjadi monosakarida penyusunnya. Laktosa dihidrolisis menjadi galaktosa dan glukosa. Monosakarida jenis manosa dan galaktosa terlebih dahulu akan diubah menjadi glukosa melalui reaksi epimerisasi. Sedangkan fruktosa akan diubah terlebih dahulu menjadi fruktosa 6-fosfat dan kemudian fruktosa 6-fosfat diubah menjadi glukosa 6-fosfat. Glukosa 6-fosfat dan glukosa hasil epimerisasi galaktosa dan manosa akan masuk dalam tahap awal proses fermentasi untuk menghasilkan asam piruvat, asam asetat dan CO₂ dan kemudian pada tahap kedua fermentasi asam piruvat dan asam asetat di reduksi kembali oleh atom hidrogen yang dilepaskan dalam tahap pertama, membentuk asam laktat dan etanol

Media yang dipakai adalah Simons citrat. Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui apakah kuman menggunakan sitrat sebagai sumber karbon. Pada media Simons citrat berisi indikator BTB (Brom Tymol Blue). Apabila bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber karbon maka media berubah menjadi basa dan berubah warna menjadi biru. Interpretasi hasil : negatif (-) : tidak terjadinya perubahan warna media dari hijau menjadi biru. Artinya bakteri ini tidak mempunyai enzim sitrat permease yaitu enzim spesifik yang membawa sitrat ke dalam sel. Sehingga kuman tidak menggunakan citra  sebagai salah satu/satu-satunya sumber karbon. Positif (+) : terjadinya perubahan warna media dari hijau menjadi biru, artinya kuman menggunakan citrat sebagai salah satu/satu-satunya sumber karbon.

Tujuan dari uji TSIA adalah untuk mengetahui kemampuan kuman untuk memfermentasikan karbohidrat. Pada media TSIA berisi 3 macam karbohidrat yaitu glukosa, laktosa dan sukrosa. Indikatornya adalah phenol red yang menyebabkan perubahan warna dari merah orange menjadi kuning dalam suasana asam. Glukosa berada di dasar media sedangkan laktosa dan sukrosa berada di bagian lereng. Selain menggunakan media TSIA dapat pula digunakan media KIA (Kligers Iron Agar), bedanya adalah pada media KIA hanya berisi 2 macam karbohidrat yaitu glukosa dan laktosa. Interpretasi hasil : hanya memfermentasi glukosa : Bila pada dasar (butt) media berwarna kuning (bersifat asam) dan lereng (slant) berwarna merah (bersifat basa),  Al/Ac atau K/A. Memfermentasi semua karbohidrat : bila pada dasar (butt) media berwarna kuning (bersifat asam) dan lereng (slant) berwarna kuning (bersifat asam), Ac/Ac atau A/A. Tidak memfermentasi semua karbohidrat : bila pada dasar (butt) media berwarna merah (bersifat basa) dan lereng (slant) berwarna merah (bersifat basa),  Al/Al atau K/K. Fermentasi pada TSIA juga disertai dengan pembentukan gas CO2 yang dapat dilihat dari pecahnya dan terangkatnya agar. Media TSIA juga dapat digunakan untuk mengetahui pembentukan H2S yaitu melihat apakah kuman memfermentasi metionin dan sistein (Asam amino yang mempunyai gugus S). Pada media TSIA terdapat asam amino metionin dan sistein, jika kuman memfermentasi kedua asam amino ini maka gugus S akan keluar dan gugus S akan bergabung dengan H2O membentuk H2S. Selanjutnya H2S bergabung dengan Fe2+ membentuk FeS berwarna hitam dan mengendap.

Pada Uji sitrat media yang digunakan adalah media Simons citrate Agar. Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui apakah kuman menggunakan sitrat sebagai sumber karbon. Pada media Simons citrat berisi indikator BTB (Brom Tymol Blue). Apabila bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber karbon maka media berubah menjadi basa dan berubah warna menjadi biru. Interpretasi hasil : negatif (-) : tidak terjadinya perubahan warna media dari hijau menjadi biru. Artinya bakteri ini tidak mempunyai enzim sitrat permease yaitu enzim spesifik yang membawa sitrat ke dalam sel. Sehingga kuman tidak menggunakan citrate  sebagai salah satu/satu-satunya sumber karbon. Positif (+) : terjadinya perubahan warna media dari hijau menjadi biru, artinya kuman menggunakan citrat sebagai salah satu/satu-satunya sumber karbon.

Pada Uji indol media yang digunakan adala media SIM (Sulfur Idom Mothyliti). Uji ini digunakan untuk mengetahui apakah kuman mempunyai enzim triptophanase sehingga kuman tersebut mampu mengoksidasi asam amino triptophan membentuk indol. Adanya indol dapat diketahui dengan penambahan reagen Ehrlich/Kovac’s yang berisi paradimetil amino bensaldehid. Interpretasi hasil : negatif (-) : Tidak terbentuk lapisan cincin berwarna merah pada permukaan biakan, artinya bakteri ini tidak membentuk indol dari triptophan sebagai sumber karbon. Positif (+) : Terbentuk lapisan cincin berwarna merah pada permukaan biakan, artinya bakteri ini membentuk indol dari triptophan sebagai sumber karbon. Selain untuk uji indol, media SIM juga diguankan untuk Uji H₂S dan uji Mothylitas bakteri. Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui gerak kuman, bisa memakai media MO (Motilitas Ornitin) atau SIM (Sulfida Indol Motility) dan juga melihat kemampuan bakteri yang dapat membentuk H₂S (Hidrogen Sulfida). Interpretasi hasil : negatif (-) : tidak terlihat adanya penyebaran yang berwarna putih seperti akar hanya pada bekas tusukan  inokulasi. Positif (+) : terlihat adanya penyebaran yang berwarna putih seperti akar disekitar inokulasi. Hal ini menunjukan adanya pergerakan dari bakteri yang diinokulasikan, yang berarti bahwa bakteri ini memiliki flagel    Media yang digunakan adalah pepton glukosa phosphat. Interpretasi dari Uji Hidrogen Sulfida yaitu : (+) terbentuk warna hitam pada media, (-) tidak terbentuk warna hitam pada media.

Media MR dalah media yang digunakan untuk mengetahui adanya fermentasi asam campuran (metilen glikon). Interpretasi hasil : negatif (-) : Tidak terjadi perubahan warna media menjadi merah setelah ditambah methyl red 1%. Positif (+) : Terjadi perubahan warna media menjadi merah setelah ditambahkan Indikator methyl red 1%. Artinya bakteri menghasilkan asam campuran (metilen glikon) dari proses fermentasi glukosa yang terkandung dalam media MR.

Media Yang digunakan yaitu media VP (Voges  Proskauer). Uji ini digunakan untuk mengetahui pembentukan asetil metil karbinol (asetoin) dari hasil fermentasi glukosa. Interpretasi hasil : negatif (-) : tidak terjadi perubahan warna media menjadi merah setelah ditambahkan @ naphtol 5% dan KOH 40%. Positif (+) : terjadi perubahan warna media menjadi merah setelah ditambahkan @ naphtol 5% dan KOH 40%, karena adanya fermentasi bakteri adalah asetil metil  karbinol (asetoin) atau bakteri memfermentasi karbohidrat menjadi 2,3-butanadio. Penambahan 40% KOH dan 5% larutan @ naphtol dalam etanol dapat menentukan adanya asetion (aseti lmetil karbonil), suatu senyawa pemuka dalam sintesis 2,3-butanadiol. Pada penambahan KOH, adanya asetion ditunjukan adanya perubahan warna kaldu menjadi warna merah muda. Perubahan warna ini diperjelas dengan penambahan larutan @napthol. Perubahan warna kaldu biakan lebih jelas pada bagian yang berhubungan dengan udara, karena sebagian 2,3-butanadiol dioksidasikan kembali menjadi asetion sehingga memperjelas hasil reaksi.

 IX.            Kesimpulan

Dari hasil praktikum dapat disimpulkan bahwa pada media SCA terjadi perubahan warna menjadi biru(+), media TSIA tidak terjadi perubahan warna(-), media SIM terbentuk warna hitam (adanya H₂S(+)) tetapi Indol dan Motility (-), media MR terbentuk warna merah (+), dan pada media VP tidak ada perubahan warna (-).